酶法试剂盒操作步骤

一、实验原理
酶法试剂盒（ELISA）实验原理是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

二、操作步骤
1.ELISA在操作前试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。按前面试剂准备中描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。

2.设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔加待测样本50μL，空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

3.温育好后揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干。如此重复4次（共洗板5次）。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡20s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。

ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
   
4.洗板好后将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min。所有孔加入终止液50μL，在酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。
   
5.检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的终浓度。

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