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日期:2024-10-18浏览:408次
RNA是由核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的长链分子,每个核糖核苷酸由磷酸、核糖和碱基组成。RNA的碱基主要有四种:腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U),其中U取代了DNA中的胸腺嘧啶(T)。RNA通常为单链结构,与DNA的双螺旋结构形成鲜明对比。此外,RNA在生物体内主要分布于细胞质,参与蛋白质的合成过程。
RNA提取是从生物样本中分离和纯化RNA分子的过程,其核心步骤包括细胞破碎和RNA的分离纯化。
以下是常用的RNA提取方法步骤:
1.样品准备:根据样本类型(如细胞、组织、血液等)进行预处理。例如,细胞样本需用预冷的PBS洗涤以去除培养基或血清;组织样本则需切成小块并在液氮中研磨成粉末。
2.细胞破碎:采用机械破碎(如高速离心、超声波破碎)、化学破碎(如使用离子表面活性剂、蛋白酶K等)或酶解(如使用RNase酶)等方法破坏细胞膜,释放RNA。
3.RNA分离与纯化:
酚/氯仿法:利用酚在碱性条件下与DNA结合的特性,通过离心将RNA留在上层水相中,随后用异丙醇沉淀RNA。
硅胶柱层析法:利用硅胶作为固相吸附材料,通过洗脱和洗涤步骤将RNA与DNA、蛋白质等杂质分离。
磁珠法:利用磁珠表面修饰物与RNA的亲和性,通过磁场作用结合RNA,再经过洗涤和洗脱步骤纯化RNA。
4.RNA沉淀与洗涤:加入异丙醇沉淀RNA,随后用75%乙醇洗涤沉淀以去除残留的蛋白质和无机盐。
5.RNA溶解与保存:将RNA沉淀晾干后,用无RNase的水或TE缓冲液溶解,并储存在-70℃条件下以防止降解。
1. 基因表达研究:通过提取不同组织或细胞中的RNA,可以对基因表达进行定量分析,研究基因在不同条件下的转录水平变化,寻找差异表达基因,并进一步探究其功能。
2. 生物医学研究:在肿瘤研究中,RNA提取技术可用于分析肿瘤相关基因的表达变化,寻找肿瘤标志物,为肿瘤的早期诊断和治疗提供依据。此外,RNA提取还广泛应用于病毒学、免疫学、发育生物学等多个领域。
3. 临床诊断:在感染性疾病的诊断中,通过提取患者样本中的RNA,可以检测病原体的核酸,从而进行病原体的定性和定量分析,辅助临床诊断和治疗监测。
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