细胞株保存技术全流程

一、保存方法选择与技术参数优化

1. 短期保存（-80℃）

冻存液配方‌

通用型：10% DMSO + 90% FBS，需预冷至4℃并与细胞悬液等体积混合

低毒性型：5% DMSO + 2% FBS + 3%海藻糖（适用于敏感细胞）

程序降温‌

采用梯度冷冻：

4℃ → -20℃（-1℃/min）→ -80℃（过夜）→液氮

使用程序降温盒可替代梯度操作

2. 长期保存（液氮）

气相保存‌

温度范围：-150℃～-190℃，需配备氧浓度监测（＜500ppm）

液相保存‌

采用双层冻存管（耐压＞500psi），推荐CryoBox™定位系统

二、标准化操作流程

2. 冻存分装规范

分装体积：≤1.5mL/管（耐高压螺纹管）

标记信息：细胞株编号+传代次数+冻存日期+操作者

3. 复苏关键步骤

快速解冻‌：37℃水浴震荡90秒（冰晶完-全消失时终止）

梯度洗涤‌：

首步加入等量预热的无血清培养基稀释

800g离心5分钟去除DMSO残留

三、质量控制体系

1. 过程监控

温度稳定性‌：

-80℃冰箱每日温差≤±2℃，液氮罐周蒸发量＜0.5L

样本追溯‌：

建立电子档案（含冻存液批号/操作人员/设备编号）

2. 风险控制

四、特殊细胞处理策略

1. 悬浮细胞

预处理：添加5%羟乙-基淀粉防止细胞聚集

冻存密度：调整为1×10⁷/mL（常规细胞的2倍）

2. 原代细胞

冻存液优化：无血清配方（含15%海藻糖+5%人血白蛋白）

分装方式：预冷冻存管+快速分装（操作时间＜3分钟）