免疫亲和纯化有那三个主要影响因素

免疫亲和纯化有那三个主要影响因素 
    影响免疫亲和纯化的因素有多种，其中zui关键的3个因素是：抗原zui初的纯度原与抗体的亲和力以及抗原抗体结合是否容易发生解离。
 
     *大因素：哪种抗原相对容易被洗脱。这*由抗原—抗体相互作用的结合键的类型和数量来决定，因此这与抗体的亲和力有关。然而亲和力并不决定抗原是否容易洗脱。用于免疫亲和纯化的理想抗体是对抗原具有高亲和力，与抗原的结合可被一种易于操作的简单而且温和的方法如pH值的改变而逆转。这些操作的设计将在后文阐述。在设计免疫亲和纯化的方法时，通常认为zui重要的是选择抗体和洗脱条件，在数种不同的洗脱条件下测试若干份有潜在使用价值的抗体，可发现高亲和力与容易洗脱的优化组合。
     第二大因素：在免疫亲和纯化技术中，抗原zui初的相对浓度是决定zui终产物纯度极为重要的因素，因为抗原一抗体的反应具有相当高的特异性，故而没有任何其他层析技术能经过一步纯化得到如此高的纯度。然而，纯化的程度不是无限的，因为使用亲和层析柱亦有某些内在的背景限制，常规纯化可以达到1000倍，大多数纯化可达10 000倍。如果所研究的蛋白质抗原非常，免疫亲和纯化必须与其他方法结合，才能获得均质性产物，这可以在免疫亲和层析之前或其后采用其他的纯化步骤来完成。常用的方法是在进行免疫亲和层析之前先将样品通过一种或多种标准层析柱。还可将免疫亲和层析纯化的产物先经过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，再转印到膜上进行微量测序。上述各种样品，由于已通过用其他方法增加其总纯度，再进行免疫亲和层析即可达到纯化。
 
    第三大因素：抗体对相应抗原的亲和力是免疫亲合纯化法遇到的zui麻烦的问题，抗体的亲和力将决定从含抗原的溶液中提取抗原的总量，高亲和力的抗体（>108mol／L）能在1h以内达到有效地分离；而低亲和力的抗体（106mol／L）即使在高浓度时也不能结合溶液中的全部抗原。值得注意的是，免疫亲和纯化达到平衡所需的总时间比其他方法如免疫沉淀显著延长，因为抗体是结合到固相支持物上，这样就大大减慢了结合速度。由此亦可采用其他更有效的免疫化学技术来捕捉抗原，如使用多克隆抗体来识别同一抗原上的多个表位，但这种方法对大多数免疫亲和纯化并不适合。正如预期的那样，通过这些方法增强亲和力可结合较多的抗原，但是在洗脱抗原时，也会遇到很多始料不及的问题。如果zui终的目的是纯化保持原有特性的蛋白，那么只能选择识别1个表位或1个短肽序列的抗体。只有当所需的zui终产物为变性蛋白时，才选用识别多个表位的抗体。
 
 
    在设计免疫亲和纯化的实验中，常见的错误是将低亲和力和容易洗脱等同看待。尽管这在某些低亲和力抗体的应用上得到证实，但通常并非总是如此，连接抗原与抗体的结合键，在高亲和力和低亲和力抗体都是同一类型（第二章）。例如，高亲和力和低亲和力的抗体都可通过盐桥和抗原结合，并且是疏水作用。在这两种情况下洗脱抗原都需要将结合键破坏，因此，选择洗脱条件就存在相同的问题。此外，低亲和力抗体还会带来新的问题，包括结合容量低；在洗脱时，连续不断从层析柱中滤去抗原，形成一个较为平坦的峰，而不是陡峭的洗脱峰。

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