过碘酸钠法在抗体的标记方法

过碘酸钠法标记HRP抗体的方法

过碘酸钠法
本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70%的HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前zui常用的方法。
1. 原理
经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH4（或乙醇胺）还原稳定的酶标记抗体。
2. 标记步骤
（1）称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
（2）于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
（3）将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃夜。
（4）加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg IgG（抗体，或SPA 5mg）在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
（5）加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃ 2小时。
（6）将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过下夜。
其余步骤（纯化）同戊二醛标记步骤的（6）、（7）、（8）。
3. 结果判定
除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
IgG量（mg/ml）＝（OD280nm-OD403nm×0.3）×0.62
4. 试剂及器材
（1）0.1M NaIO4：称取241mg高碘酸钠（广州化学试剂厂，批号830602）溶于蒸馏水10ml中。
（2）1mM PH4.4醋酸钠缓冲液：0.2M NaAc （1.361克/50ml）  3.7ml；0.2M HAc （0.601ml/50ml）  6.3ml；加蒸馏水至2,000ml。
（3）0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液：Na2CO3 0.32g；NaHCO3 0.586g；加蒸馏水至50ml，再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。
（4）NaBH4溶液（4mg/ml）：临用时称取NaBH4 4mg溶于1ml蒸馏水中。
（5）其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。

ELISA测定模式包括以下几种：双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM抗体捕捉法、竞争抑制法，其中竞争抑制法（HBeAb,HBcAb等采用）因受操作时差所引起的不公平竞争等因素的影响，结果重复性较差，质量较难控制。选择沪鼎生物，您将得到高质量的产品、实惠的价格、的服务、快捷的到货、稳定的货源、