ELISA试剂盒实验常见问题分析

异常

结果描述

原因分析

对策

白板

显色步骤结束后，酶标板所有孔均无颜色。阳性对照不显色。

试剂已过效期，或不同试剂盒组分混用

检查试剂的组分及批号，确认未过期以及所有组分均属对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。

错加、漏加试剂底物、显色剂A或B

严格按说明书的步骤操作，加完试剂后可观察一下液面高度是否一致，以减少漏加现象。

洗板及加样过程中，酶标受污染失活失去催化显色剂显色的能力

确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净。

终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配制

每次配制时都应看清标签标明物质

蒸馏水有问题

确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染，与好蒸馏水比较。

显色弱、灵敏度低

实验结束后，包括阳性对照、质控在内的所有板孔颜色均较淡。

试剂盒超过期， 超过有效期的产品可能会产生很弱的信号； 试剂盒没有按规定进行保存，受高温影响；

实验前检查试剂的组分及批号，确认试剂未过期。 不要将试剂盒长时间置于常温下，按使用规定储藏。

试剂、样品用前未平衡至室温

从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平衡 20分钟左右。

加入试剂的体积和时间有误，移液器计量不准，吸嘴内水分太多或不清洁；

确定所使用的试剂体积正确，加入时间适当。 校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快，排放应*。

洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力

确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净，确认配制洗液的纯化水达到要求且未受污染。

孵育时间及孵育温度未达到要求 ，反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。

孵育温度应控制在 37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。 保温期内不宜多开门，以免影响保温。

洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求；洗涤冲击力太大。浸泡时间太长；

严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板，减小洗涤冲击力，按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数。

显色剂加量不足或顺序颠倒，或混合后加入；

显色剂滴瓶垂直向下，持力均匀，滴速不宜过快，先加显色剂 A，后加显色剂B，不可将A、B液混合后加入

底物作用时间不够；

准确定时。

蒸馏水水质有问题；

测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响。

实验结束后，阴阳性对照正常，质控正常，但临床标本感觉显色较弱

待测标本中可能不含强阳性标本，故结果可能是正常的

如有怀疑，可复检

标本加入叠氮钠作为防腐剂

酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用 proclin、硫柳汞等其他防腐剂

阴阳性对照正常，但质控、参考品或个别弱阳性标本未能检出。

未达要求的孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本，但 质控或弱阳性标本受 温度变化影响较大而被未检出

质控品或标本避免反复冻融。标本在一周内使用的，可存于 2-8℃，如需长期保存，应置于-20℃以下保存。质控品应小量分装，并置于-20℃以下保存。

质控品或标本高温放置过久，或被反复冻融致待测物滴度下降，而未能检出

重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。

仪器设定不正确，滤光片不匹配

重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配

灵敏度过高、板底高、高背景

终止后，整板结果显现均一的黄色或淡黄色；或阴阳性对照、质控正常，标本阴性标本 OD值过高。

整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成，如同时操作两对半试剂时，测 HbsAb板用于测HBsAg等；

实验前检查试剂的组分及批号，确认所有组分均属于对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用

酶标对吸头的污染以及对盛放显色剂容器的污染都易造成黄板现象；

避免试剂组分间的交叉污染，确保吸头、容器的干净

显色剂在光照条件下放置过久，实验前已变蓝

显色剂 A、B未使用前避光保存

孵育温度过高或孵育时间过长；

孵育温度应控制在 37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。

未按要求洗板。特别是洗涤时每孔未注满洗液，易造成花板黄板现象

严格按说明书要求洗板

花板，一般是由于临床标本的收集、处理和保存方法不当造成

放置时间（自然放置 1~2h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意。

出现随机性的花板、跳孔现象

样品离心不*，反应孔内发生凝血或残留细胞成分；

充分离心， 3000rpm6分钟以上。

加样时交叉污染；

加标本时尽量 避免交叉污染。如盛标本的试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板。

手工洗板造成的交叉污染

手工洗板时前 3次注洗液后应立即弃去，后几次再设定浸泡时间，可减少交叉污染

洗板机加液头堵塞导致加液不满或吸液残留量较大，造成 花板、跳孔

疏通加液头，使洗板时每孔均注满洗液，吸液时残留量要小。

拍板时交叉污染

洗板完毕拍板时用合适的吸水纸巾，不要把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍，以免交叉污染。

假阳性

假阳性现象是一个综合现象，可参考上文“灵敏度过高、板底高、高背景”中的分析。这里只列举常见的原因及对策。

计算 Cutoff值时使用的公式不正确，导致计算得出的CutOff值过低，从而导致出现假阳性

CutOff值计算公式应严格参照所属产品的说明书，应注意各个酶免产品的Cutoff值计算公式不尽相同

洗板时未能注满洗液或洗板次数、浸泡时间不够， 洗涤不充分，样品中有其他成分残留 导致花板、跳孔，假阳性增多

严格按说明书要求洗板。调整洗板机时，应注意有时仪器标示的液量与实际液量并不相符，应根据实际情况调整至每孔注满。

血清标本处理不当，如未除去细胞成分、纤维蛋白原及其它干扰物可出现孔底由变蓝的跳孔现象，此标本重复实验结果往往是阴性；

放置时间（自然放置 1~2h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意

厂家试剂质量的变化造成

国家标准要求提高灵敏度时，厂家试剂灵敏度也相应提高，假阳率常常有所上升，但只要在合理范围，是可以接受的

水质问题

防止蒸馏水污染

加酶量过多（如 50uL误认为100uL）或丙肝酶稀释时加量过多

加酶前检查移液器调节量是否准确，稀释酶时思想要集中

培养箱温度超过 37℃</